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在實(shí)驗(yàn)室的精密世界里，數(shù)據(jù)就是生命。而高效液相色譜儀（HPLC）作為分析領(lǐng)域的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”，其狀態(tài)的優(yōu)劣直接決定了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。一臺(tái)未經(jīng)精準(zhǔn)校準(zhǔn)的HPLC，就像一把刻度模糊的尺子，測(cè)量結(jié)果自然令人難以信服。本文將為您系統(tǒng)梳理HPLC校準(zhǔn)的核心范圍、主流方法及關(guān)鍵注意事項(xiàng)，助您牢牢守住數(shù)據(jù)質(zhì)量的生命線。

一、校準(zhǔn)范圍：全面覆蓋，不留死角

HPLC的校準(zhǔn)絕非簡(jiǎn)單“調(diào)零”，而是一項(xiàng)系統(tǒng)工程，需覆蓋影響分析結(jié)果的各個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)：

輸液系統(tǒng)：這是HPLC的“心臟”。

流量精度與準(zhǔn)確度：確保流速穩(wěn)定且與設(shè)定值一致。即使微小的偏差（如1%），在長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)行或方法轉(zhuǎn)移時(shí)也會(huì)導(dǎo)致保留時(shí)間漂移和定量誤差。

梯度組成準(zhǔn)確度：對(duì)于梯度洗脫方法，必須驗(yàn)證不同比例下流動(dòng)相組成的準(zhǔn)確性，這對(duì)復(fù)雜分離至關(guān)重要。

檢測(cè)器系統(tǒng)：這是儀表的“眼睛”。

紫外/可見光（UV-Vis）檢測(cè)器：需校準(zhǔn)波長(zhǎng)準(zhǔn)確度（確保在正確波長(zhǎng)下檢測(cè)）和光度準(zhǔn)確性（確保吸光度讀數(shù)準(zhǔn)確）。

熒光檢測(cè)器（FLD）：校準(zhǔn)激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)準(zhǔn)確度，以及靈敏度。

示差折光檢測(cè)器（RID）：校準(zhǔn)基線穩(wěn)定性和靈敏度。

二極管陣列檢測(cè)器（DAD）：除波長(zhǎng)和光度準(zhǔn)確性外，還需關(guān)注光譜分辨率。

柱溫箱：溫度的“恒溫器”。

溫度準(zhǔn)確度與穩(wěn)定性：溫度直接影響保留時(shí)間、分離度和峰形。必須驗(yàn)證設(shè)定溫度與實(shí)際溫度的一致性，及其在運(yùn)行過(guò)程中的波動(dòng)范圍。

自動(dòng)進(jìn)樣器：精確的“采樣手”。

進(jìn)樣體積精度與準(zhǔn)確度：尤其對(duì)小體積進(jìn)樣（如10μL以下），微小的誤差會(huì)直接放大為顯著的定量錯(cuò)誤。

攜帶污染：評(píng)估高濃度樣品對(duì)后續(xù)低濃度樣品分析的影響。

表1.HPLC校準(zhǔn)核心范圍及關(guān)鍵指標(biāo)

二、校準(zhǔn)方法：遵循權(quán)威，步步為營(yíng)

規(guī)范的校準(zhǔn)必須依據(jù)公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)，通常采用以下方法：

依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程：嚴(yán)格遵循 《JJG 705-2014 液相色譜儀》國(guó)家計(jì)量檢定規(guī)程 或權(quán)威藥典（如USP、EP、ChP）中的相關(guān)章節(jié)。這些標(biāo)準(zhǔn)詳細(xì)規(guī)定了校準(zhǔn)項(xiàng)目、使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、環(huán)境條件、具體步驟和可接受標(biāo)準(zhǔn)。

使用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（CRM）：校準(zhǔn)的核心。例如：

流量校準(zhǔn)：使用經(jīng)過(guò)計(jì)量的微量量筒和秒表，或更精密的電子流量計(jì)。

紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)校準(zhǔn)：使用氧化鈥濾光片或特定波長(zhǎng)溶液（如苯甲醇的甲醇溶液）。

光度準(zhǔn)確性校準(zhǔn)：使用重鉻酸鉀的硫酸溶液等標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

梯度準(zhǔn)確性校準(zhǔn)：采用紫外示差法或電導(dǎo)法進(jìn)行測(cè)定。

執(zhí)行系統(tǒng)適用性試驗(yàn)（SST）：在分析方法框架下，使用特定測(cè)試混合物（常含尿嘧啶、硝基苯、苯甲醚等）評(píng)估系統(tǒng)的整體性能，包括理論塔板數(shù)、拖尾因子、分離度和重復(fù)性。這是將儀器校準(zhǔn)與實(shí)際應(yīng)用連接的橋梁。

表2.HPLC校準(zhǔn)方法及依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)

三、關(guān)鍵注意事項(xiàng)：細(xì)節(jié)決定成敗

3.1建立動(dòng)態(tài)、分層的校準(zhǔn)周期體系（核心擴(kuò)充內(nèi)容）

校準(zhǔn)絕非“一勞永逸”或“一成不變”。建立一個(gè)科學(xué)、分層的周期體系，是平衡運(yùn)行成本與數(shù)據(jù)風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)鍵。

1. 法定周期性檢定（長(zhǎng)周期基礎(chǔ)校準(zhǔn)）：

周期： 通常為一年。這是指由法定計(jì)量機(jī)構(gòu)或取得資質(zhì)的內(nèi)部計(jì)量部門，依據(jù)國(guó)家檢定規(guī)程（JJG）進(jìn)行的全面、強(qiáng)制性檢定，并出具具有法律效力的檢定證書。這是儀器合規(guī)性的“基石”。

2. 內(nèi)部性能核查/校準(zhǔn)（中周期核心校準(zhǔn)）：

周期： 建議每3至6個(gè)月，或根據(jù)使用頻率和關(guān)鍵程度進(jìn)行調(diào)整。

內(nèi)容： 由實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部資深人員，使用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（CRM），對(duì)流量、檢測(cè)器波長(zhǎng)與光度準(zhǔn)確性、梯度準(zhǔn)確性、柱溫箱溫度、自動(dòng)進(jìn)樣器精度等核心參數(shù)進(jìn)行系統(tǒng)性測(cè)試與調(diào)整。此周期校準(zhǔn)是確保儀器長(zhǎng)期性能飄移受控的核心環(huán)節(jié)。

3. 方法相關(guān)的系統(tǒng)適用性測(cè)試（短周期/每批次驗(yàn)證）：

周期： 每次開機(jī)后、每個(gè)分析批次開始前，或連續(xù)運(yùn)行中每隔一定時(shí)間（如24小時(shí)）。

內(nèi)容： 執(zhí)行特定分析方法的“系統(tǒng)適用性試驗(yàn)（SST）”，使用該方法的測(cè)試混合標(biāo)樣，驗(yàn)證理論塔板數(shù)、拖尾因子、分離度、重復(fù)性（RSD） 等指標(biāo)是否達(dá)標(biāo)。這是將儀器狀態(tài)與當(dāng)前分析任務(wù)直接掛鉤的“實(shí)時(shí)健康檢查”，確保即時(shí)數(shù)據(jù)的有效性。

4. 觸發(fā)式校準(zhǔn)（非周期，事件驅(qū)動(dòng)）：

遇到以下情況，必須在問(wèn)題解決后立即執(zhí)行相關(guān)校準(zhǔn)，無(wú)論上次校準(zhǔn)在何時(shí)：

儀器移動(dòng)或搬遷后。

關(guān)鍵硬件更換或維修后（如泵頭、密封圈、檢測(cè)器燈、流通池、自動(dòng)進(jìn)樣器注射器等）。

分析結(jié)果出現(xiàn)無(wú)法解釋的異常趨勢(shì)或偏差時(shí)（如保留時(shí)間系統(tǒng)性漂移、峰面積重復(fù)性變差、基線異常）。

執(zhí)行新的、極其關(guān)鍵的或?qū)纫髽O高的分析項(xiàng)目前。

經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間停機(jī)后重新啟用。

制定策略的建議： 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)基于儀器的使用頻率、分析任務(wù)的關(guān)鍵性（如研發(fā)、質(zhì)檢、放行）、所遵循的質(zhì)量體系要求（GMP/GLP, ISO 17025）以及歷史性能數(shù)據(jù)，書面化規(guī)定每臺(tái)HPLC的校準(zhǔn)周期策略，并嚴(yán)格執(zhí)行和記錄。

3.2 校準(zhǔn)前充分準(zhǔn)備

（此部分與之前內(nèi)容保持一致，略作銜接）在執(zhí)行任何層級(jí)的校準(zhǔn)前，都必須確保儀器狀態(tài)穩(wěn)定。進(jìn)行必要的維護(hù)（如更換密封圈、清洗泵頭、沖洗流通池），并在規(guī)定的環(huán)境條件下穩(wěn)定數(shù)小時(shí)。務(wù)必使用HPLC級(jí)溶劑和新鮮配制的流動(dòng)相與標(biāo)準(zhǔn)溶液。

3.3 完整記錄，形成溯源鏈

（此部分與之前內(nèi)容保持一致）詳細(xì)記錄每次校準(zhǔn)（包括周期性檢定、內(nèi)部校準(zhǔn)、SST）的日期、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)信息、環(huán)境條件、原始數(shù)據(jù)、計(jì)算結(jié)果、執(zhí)行人員及結(jié)論。所有記錄應(yīng)可追溯，這是質(zhì)量體系的剛性要求。

3.4 理解“校準(zhǔn)”與“核查/驗(yàn)證”的層級(jí)關(guān)系

（此部分整合優(yōu)化）應(yīng)明確區(qū)分：

校準(zhǔn)： 通過(guò)操作建立測(cè)量?jī)x器輸出值與標(biāo)準(zhǔn)值之間的關(guān)系，可能涉及調(diào)整（如調(diào)整波長(zhǎng)、補(bǔ)償流量）。

檢定： 法定的全面校準(zhǔn)，結(jié)論為“合格”或“不合格”。

核查/驗(yàn)證（如SST）： 在不做調(diào)整的情況下，確認(rèn)儀器性能是否滿足特定預(yù)期用途的要求。

它們共同構(gòu)成了一個(gè)從“法定符合”到“全面性能”再到“即時(shí)可用”的完整質(zhì)量保障金字塔。

表3.HPLC分層校準(zhǔn)周期及觸發(fā)條件

常見問(wèn)題答疑（FAQ）：破解校準(zhǔn)實(shí)戰(zhàn)疑惑

在實(shí)際操作中，用戶常會(huì)遇到一些典型困惑。以下精選三個(gè)高頻問(wèn)題，為您提供清晰解答：

Q1：我們的HPLC每年都送外檢定且合格，為什么日常分析中，數(shù)據(jù)的重復(fù)性有時(shí)還是會(huì)出現(xiàn)問(wèn)題？

A1： 年度檢定合格，僅代表儀器在送檢時(shí)的那一時(shí)刻，其核心計(jì)量參數(shù)符合國(guó)家規(guī)程的寬泛要求。它無(wú)法保證儀器在長(zhǎng)期、高頻次、特定分析方法下的持續(xù)穩(wěn)定。數(shù)據(jù)重復(fù)性問(wèn)題，更多與以下因素相關(guān)：

日常性能漂移： 泵密封圈磨損導(dǎo)致的微小流量波動(dòng)、檢測(cè)器燈能量衰減、色譜柱效能下降等，都會(huì)在檢定周期內(nèi)發(fā)生。

解決方法： 這正是加強(qiáng)內(nèi)部季度校準(zhǔn)和嚴(yán)格執(zhí)行每批次系統(tǒng)適用性試驗(yàn)（SST） 的意義所在。SST能直接暴露當(dāng)前方法下儀器狀態(tài)的微小變化，是確保日常數(shù)據(jù)可靠的第一道防線。

Q2：校準(zhǔn)過(guò)程中，如果某個(gè)參數(shù)（如自動(dòng)進(jìn)樣器精度）略微超出標(biāo)準(zhǔn)，但勉強(qiáng)能用，可以忽略嗎？

A2：絕對(duì)不可以。 “勉強(qiáng)能用”是分析實(shí)驗(yàn)室的大忌。校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)是保證數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性的底線。

風(fēng)險(xiǎn)： 一個(gè)參數(shù)的微小偏差，可能會(huì)被后續(xù)的分析步驟放大。例如，自動(dòng)進(jìn)樣器1%的體積誤差，可能導(dǎo)致定量結(jié)果出現(xiàn)系統(tǒng)性偏差，在痕量分析或含量均勻度檢查中會(huì)造成誤判。

正確處理流程：

立即停止使用該儀器進(jìn)行正式樣品分析。

排查原因： 檢查進(jìn)樣針是否堵塞、彎曲，密封圈是否泄漏，沖洗程序是否充分。

維修與再校準(zhǔn)： 進(jìn)行必要的維護(hù)或部件更換后，必須重新對(duì)該參數(shù)進(jìn)行校準(zhǔn)，直至其完全符合標(biāo)準(zhǔn)，并記錄整個(gè)偏差處理過(guò)程。

Q3：對(duì)于主要用于教學(xué)或初步篩選的非關(guān)鍵項(xiàng)目，HPLC的校準(zhǔn)可以簡(jiǎn)化或延長(zhǎng)周期嗎？

A3： 校準(zhǔn)的嚴(yán)格程度應(yīng)與 “測(cè)量結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)影響” 相匹配。但“簡(jiǎn)化”不等于“取消”。

基本原則： 即使對(duì)于非GMP/GLP的研究或教學(xué)用途，也應(yīng)保證數(shù)據(jù)的基本可信度與教學(xué)演示的正確性。

建議方案：

周期可以適當(dāng)延長(zhǎng)， 例如內(nèi)部性能校準(zhǔn)可調(diào)整為6-12個(gè)月，但仍需進(jìn)行年度檢定以確保儀器基礎(chǔ)功能正常。

校準(zhǔn)項(xiàng)目可以聚焦核心： 可重點(diǎn)關(guān)注流量準(zhǔn)確性、檢測(cè)器波長(zhǎng)等影響基本定性與相對(duì)定量的參數(shù)。

日常驗(yàn)證不可省： 每次使用前，必須進(jìn)行基本的系統(tǒng)適用性測(cè)試（如進(jìn)樣標(biāo)準(zhǔn)品檢查保留時(shí)間和峰面積的重復(fù)性）。這既能保證當(dāng)次數(shù)據(jù)可用，也是培養(yǎng)學(xué)生良好科研習(xí)慣的關(guān)鍵。

高效液相色譜儀的校準(zhǔn)，是一項(xiàng)融合了技術(shù)、標(biāo)準(zhǔn)與動(dòng)態(tài)管理思維的嚴(yán)謹(jǐn)工作。通過(guò)建立并嚴(yán)格執(zhí)行一套 “法定周期為基礎(chǔ)、內(nèi)部校準(zhǔn)為核心、系統(tǒng)適用性為日常、事件觸發(fā)為保障” 的立體化、分層校準(zhǔn)周期體系，并厘清常見操作誤區(qū)，您不僅能滿足合規(guī)性要求，更能主動(dòng)駕馭儀器性能，將數(shù)據(jù)風(fēng)險(xiǎn)降至低。投資于這樣一套科學(xué)的校準(zhǔn)策略，就是為實(shí)驗(yàn)室的每一份報(bào)告、每一項(xiàng)發(fā)現(xiàn)，鑄就堅(jiān)實(shí)的可信度基石。