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高效液相色譜儀原理及操作步驟和注意事項(xiàng)【圖文】
更新時(shí)間：2025-06-30
高效液相色譜儀是是一種基于經(jīng)典液相色譜法，結(jié)合氣相色譜理論和實(shí)驗(yàn)技術(shù)的新型液相色譜分析法，廣泛應(yīng)用于藥物分析、環(huán)境檢測(cè)、食品安全及生化研究等領(lǐng)域。其核心原理是通過(guò)高壓驅(qū)動(dòng)流動(dòng)相攜帶樣品通過(guò)固定相色譜柱，利用各組分在兩相間分配系數(shù)的差異實(shí)現(xiàn)分離，并由檢測(cè)器定量分析。依利特為您整理HPLC的工作原理、標(biāo)準(zhǔn)化操作步驟及使用注意事項(xiàng)，確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性與儀器的高效運(yùn)行。
高效液相色譜原理
高效液相色譜儀(HPLC)是應(yīng)用高效液相色譜原理，主要用于分析高沸點(diǎn)不易揮發(fā)的、受熱不穩(wěn)定的和分子量大的有機(jī)化合物的儀器設(shè)備。它由儲(chǔ)液器、泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器、記錄儀等幾部分組成。儲(chǔ)液器中的流動(dòng)相被高壓泵打入系統(tǒng)，樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入流動(dòng)相，被流動(dòng)相載入色譜柱(固定相) 內(nèi)，由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù)，在兩相中做相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，經(jīng)過(guò)反復(fù)多次的吸附- 解吸的分配過(guò)程，各組分在移動(dòng)速度上產(chǎn)生較大的差別，被分離成單個(gè)組分依次從柱內(nèi)流出，通過(guò)檢測(cè)器時(shí)，樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號(hào)傳送到記錄儀，數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來(lái)。
高效液相色譜儀操作工序：
一：配置好實(shí)驗(yàn)所需的流動(dòng)相(甲醇:水=8:2)和純甲醇，經(jīng)過(guò)濾超聲后備用。
二：打開(kāi)泵電源。將泵的壓力上限設(shè)置為40MPa。(已設(shè)定好，可不用再設(shè)定)
1.將泵的過(guò)濾頭輕輕放入到新配好的純甲醇中，設(shè)置流量為1ml,然后按“啟動(dòng)/停止”鍵開(kāi)始走液，經(jīng)過(guò)10-20分鐘后按“啟動(dòng)/停止”鍵停止走液。
2.將泵的過(guò)濾頭輕輕放入到新配好的甲醇水中，然后按“啟動(dòng)/停止”鍵開(kāi)始走液。
3.打開(kāi)檢測(cè)器電源，調(diào)整好檢測(cè)器的波長(zhǎng)280(已設(shè)定好，可不用再設(shè)定)，然后按“調(diào)零”鍵調(diào)零。
三：打開(kāi)電腦上的UC-3268色譜工作站，左上方出現(xiàn)握手圖標(biāo)，說(shuō)明工作站已連接儀器。然后查看基線(xiàn)等基線(xiàn)走直即可進(jìn)樣。
四：進(jìn)樣之前先看基線(xiàn)在不在界面內(nèi)，如果不在按“調(diào)零”鍵調(diào)零，之后再開(kāi)始進(jìn)標(biāo)樣，將液體進(jìn)樣閥扳到“LOAD”位置，將標(biāo)樣打入液體進(jìn)樣閥內(nèi)，再把液體進(jìn)樣閥扳到“INJECT”位置,此時(shí)工作站已啟動(dòng)，等峰出完后點(diǎn)“停止”鍵。
五:做校正曲線(xiàn)
1.編輯定量參數(shù)點(diǎn)擊“定量參數(shù)”圖標(biāo)，彈出方法編輯窗口：設(shè)置好“定量方式：（峰面積）”、“定量方法（外標(biāo)法）”、“標(biāo)準(zhǔn)（1個(gè)濃度標(biāo)樣，選‘1點(diǎn)’”）、“次方（1次）”、“標(biāo)樣濃度單位（%）”、“樣品結(jié)果單位（%）”。
2.填寫(xiě)組份表
點(diǎn)擊“組份表”圖標(biāo)，彈出方法編輯窗口，填入所分析的樣品組份名稱(chēng)（辣椒素）、保留時(shí)間（5.2分鐘左右）及標(biāo)準(zhǔn)濃度（100）。
3.定義校正曲線(xiàn)
點(diǎn)擊“校正曲線(xiàn)”圖標(biāo)，彈出方法編輯窗口。定義各點(diǎn)對(duì)應(yīng)的色譜峰文件。即先用鼠標(biāo)指向標(biāo)樣點(diǎn)號(hào)，然后單擊左鍵，則該點(diǎn)號(hào)被藍(lán)框覆蓋，再單擊右鍵，彈出右鍵可選菜單：
選擇“增加”項(xiàng)（此項(xiàng)操作即表示同一個(gè)濃度點(diǎn)，可以加入幾個(gè)平行實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)來(lái)進(jìn)行平均計(jì)算），彈出“譜圖選擇”窗口。然后在此選擇相應(yīng)的譜圖文件，則該序號(hào)點(diǎn)的文件前出現(xiàn)一個(gè)“+”號(hào)。各個(gè)點(diǎn)定義完成后，單擊“重校正”即可顯示出校正曲線(xiàn)。點(diǎn)“確認(rèn)”鍵。
六:進(jìn)樣品，出完峰后點(diǎn)停止，點(diǎn)屏幕報(bào)告即可查看結(jié)果。如有多個(gè)樣品，可重復(fù) 進(jìn)樣品 此步驟即可。
七:查看以前樣品結(jié)果
進(jìn)入“再處理”界面，點(diǎn)擊“打開(kāi)數(shù)據(jù)文件”圖標(biāo)，彈出“譜圖選擇”窗口在此選擇樣品譜圖文件，如下：
然后要單擊“重新計(jì)算”按鈕，再點(diǎn)擊“屏幕報(bào)告”圖標(biāo)，即可看到屏幕報(bào)告表：
八:關(guān)機(jī)
關(guān)閉檢測(cè)器電源，按“啟動(dòng)/停止”鍵停止泵運(yùn)行，將泵的過(guò)濾頭輕輕放入到新配好的純甲醇中，按“啟動(dòng)/停止”鍵開(kāi)始走液，經(jīng)過(guò)10-20分鐘，泵壓力穩(wěn)定后，按“啟動(dòng)/停止”鍵停止走液，關(guān)閉泵電源。電腦不用可提前關(guān)閉。
液相色譜儀結(jié)構(gòu):
1、溶劑輸送系統(tǒng)；儲(chǔ)液器，用來(lái)貯存數(shù)量足夠、符合要求的流動(dòng)相。配有溶劑過(guò)濾器，以防止流動(dòng)相中的顆粒進(jìn)入泵內(nèi)。脫氣器，脫氣的目的是為了防止流動(dòng)相從色譜柱內(nèi)流出時(shí)釋放出氣泡進(jìn)入檢測(cè)器，從而引起噪聲，不能正常檢測(cè)。
輸液泵，將儲(chǔ)液器中的流動(dòng)相連續(xù)不斷地以高壓形式進(jìn)入液路系統(tǒng)，使樣品在色譜柱中完成分離過(guò)程。梯度洗脫裝置，是在分離過(guò)程中通過(guò)逐漸改變流動(dòng)相的組成增加洗脫能力的一種裝置。
2、進(jìn)樣系統(tǒng)；進(jìn)樣器：是將樣品送入色譜柱的裝置，進(jìn)樣方式可以分為兩種：閥進(jìn)樣或自動(dòng)進(jìn)樣。比較常用的是采用自動(dòng)進(jìn)樣器裝樣。
3、分離系統(tǒng)；色譜柱：對(duì)樣品進(jìn)行分離，是整個(gè)色譜系統(tǒng)的心臟，它的質(zhì)量?jī)?yōu)劣直接影響到分離的效果。
4、檢測(cè)系統(tǒng)；檢測(cè)器：將色譜柱連續(xù)流出的樣品組分轉(zhuǎn)變成易于測(cè)量的電信號(hào)，被數(shù)據(jù)系統(tǒng)接收，得到樣品分離的色譜圖。
5、數(shù)據(jù)處理和記錄系統(tǒng)；對(duì)色譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，并參與HPLC儀器的自動(dòng)控制。
液相色譜儀注意事項(xiàng)：
1、泵正常工作時(shí)，在流動(dòng)相和流速不變的前提下柱壓應(yīng)該是穩(wěn)定的，當(dāng)然在換流動(dòng)相時(shí)壓力變化是正常的，正常情況下如果柱壓升高基本上都是由色譜柱使用時(shí)間長(zhǎng)引起的（只有更換色譜柱），如果正常情況下壓力突然降低有可能是（1）接頭處有漏液的地方，采取的方法是有濾紙檢查，如有漏液的地方用扳手?jǐn)Q緊即可。如果沒(méi)有漏液則可能是（2）白色的管子里面有氣泡從而導(dǎo)致流動(dòng)相進(jìn)不到泵里面去，采取的方法是排氣泡。排氣時(shí):先STOP停泵--打開(kāi)排氣閥--按PURGE（快沖）鍵--等氣泡排完后先STOP停泵--擰緊排氣閥，其先后步驟不要搞反了。
2、泵正常工作時(shí)最高壓力最好不要超過(guò)200KG，所以打開(kāi)泵以后可以將泵的zui大壓力調(diào)到200KG，這樣如果壓力超過(guò)上限則會(huì)自動(dòng)報(bào)警停機(jī)，流速zui好不用超過(guò)1ML/MIN，如果使用時(shí)壓力超過(guò)200KG，建議將流速調(diào)低點(diǎn)以降低壓力（在色譜柱正常的情況下），如果是因?yàn)樯V柱長(zhǎng)時(shí)間使用造成壓力升高則建議更換色譜柱（因?yàn)樯V柱屬于耗材長(zhǎng)時(shí)間使用就需要更換，更換的主要依據(jù)色譜柱出峰不正?；蛘咧鶋毫^(guò)高）。
3、泵正常工作時(shí)平均每15天左右向注油孔加潤(rùn)滑油2-3滴。
4、流動(dòng)相里面如果有鹽或酸類(lèi)，做完實(shí)驗(yàn)后要先用95%二次蒸餾水與5%甲醇洗色譜柱40分鐘左右，然后用純甲醇洗30分鐘左右才可以關(guān)機(jī)。第二天如果繼續(xù)做實(shí)驗(yàn)流動(dòng)相里面仍舊有鹽或酸類(lèi)，zui好先用95%二次蒸餾水與5%甲醇過(guò)渡20分鐘，再用流動(dòng)相。如果流動(dòng)相里面只有甲醇，水，乙腈，做完實(shí)驗(yàn)后就不用95%二次蒸餾水5%甲醇沖洗，可直接用純甲醇洗30分鐘即可關(guān)機(jī)。
5、色譜柱的耐酸PH值范圍3-8使用時(shí)不要超出。
6、儀器長(zhǎng)期不用時(shí)一定要將濾頭泡在甲醇里半月開(kāi)機(jī)一次，如果開(kāi)機(jī)時(shí)泵抽不上液可以打開(kāi)排氣閥按PURGE快沖。
7、調(diào)反壓器時(shí)要注意等液體流出來(lái)以后才能調(diào)，一般調(diào)8--10KG，比如現(xiàn)在泵顯示屏顯示柱壓50KG那再增加10KG顯示屏上顯示柱壓60KG然后擰緊鎖緊螺母。
8、關(guān)機(jī)順序：清洗液路時(shí)可以把檢測(cè)器直接關(guān)機(jī)，清洗結(jié)束后先按STOP讓泵停止后再關(guān)電源，不允許直接關(guān)機(jī)
依利特30年來(lái)始終專(zhuān)注于色譜技術(shù)的研發(fā)與應(yīng)用，構(gòu)建了涵蓋“實(shí)驗(yàn)室理化分析、新興生物技術(shù)上游純化、臨床分析檢測(cè)”三位一體的業(yè)務(wù)布局。其產(chǎn)品線(xiàn)廣泛覆蓋實(shí)驗(yàn)室分析、生物制藥純化及臨床檢測(cè)等領(lǐng)域，包括1100/3100/3200/3200L系列高效液相色譜儀、色譜工作站軟件、MS2 Vertical 9100三重四極桿質(zhì)譜儀、氣相色譜儀、制備純化色譜系統(tǒng)、計(jì)量泵、色譜柱及其配件等核心產(chǎn)品。經(jīng)過(guò)三十年的技術(shù)積累，公司持續(xù)深化色譜技術(shù)在各領(lǐng)域的應(yīng)用，推動(dòng)分析檢測(cè)與純化技術(shù)的創(chuàng)新發(fā)展。
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